VIVOS VOCO: В.П. Ширинский, А.В. Воротников, "Клеточная подвижность в сердечно-сосудистой системе"

Клеточная подвижность
в сердечно-сосудистой системе

В.П. Ширинский, А.В. Воротников

Владимир Павлович Ширинский, д.б.н., зав. лаб. клеточной подвижности
НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава.
Александр Вячеславович Воротников, к.б.н., в.н.с. той же лаборатории.

Вопреки бытующему мнению, двигательной активностью обладают все без исключения клетки организма. Хотя двигательные реакции многих из них не столь очевидны, как мышечное сокращение, они не менее важны для поддержания гомеостаза. К примеру, иммунитет невозможен без амебоидного движения лейкоцитов и поглощения ими бактерий и обломков клеток; рост организма происходит в результате деления любых клеток, начиная со стволовой. Ни секреция гормонов и ростовых факторов, ни синаптическая передача нервного импульса, ни свертывание крови тромбоцитами, ни поглощение пищевых частиц кишечным эпителием, как и многие другие протекающие в организме процессы, не могут обходиться без двигательного компонента. Даже внутри клетки ситуация далека от статичной: многие органеллы постоянно перемещаются, и это активный процесс, требующий участия моторных белков и энергетических затрат.

Моторные белки

Молекулярные моторы клетки делятся на два основных типа: миозины и кинезины. Их принципиальное различие в том, что движутся они по разным внутриклеточным "дорогам": миозины - вдоль микрофиламентов, состоящих из белка актина и добавочных компонентов, а кинезины перемещают грузы (везикулы, митохондрии) по микротрубочкам, построенным из белка тубулина. В настоящее время идентифицировано множество различных миозино- и кинезинподобных молекулярных моторов, которые продуцируются независимыми генами. Однако у них есть общее свойство - они способны превращать химическую энергию универсального клеточного топлива аденозинтрифосфата (АТФ) в механическую работу. За счет этой энергии миозины и кинезины обратимо связывают актин или тубулин и меняют свою конформацию, что позволяет им создавать тянущие усилия и продвигаться вдоль микрофиламентов и микротрубочек.

В клетке, как в любой сложной двигательной системе, функции у молекулярных моторов различны, и не все моторы взаимозаменяемы. Основным из них считается миозин II, поскольку именно этот белок обеспечивает сокращение скелетных мышц, сердца, кровеносных сосудов, перистальтику желудочно-кишечного тракта и родовую деятельность. Впервые миозин был выделен из скелетных мышц в начале XX в. Отечественной биохимической школе принадлежит приоритет установления его свойства как хемомеханического преобразователя. В 1939-1942 гг. В.А.Энгельгардт и М.Н.Любимова описали способность миозина гидролизовать АТФ и сокращать актомиозинный гель. В результате электронномикроскопических и биохимических исследований миозина выяснилось, что его молекула состоит из пары крупных полипептидов (тяжелых цепей), формирующих две головки и длинный хвост, а также двух пар мелких полипептидов (легких цепей). В головках сосредоточены актин-связывающая и моторная активности миозина, а хвосты взаимодействуют между собой и собирают отдельные молекулы миозина в филамент. Движение по типу сокращения происходит за счет концентрации моторных доменов, расположенных на противоположных концах филамента и развивающих тянущее усилие навстречу друг другу. Расшифровка структуры миозиновой головки в 1993 г. стала крупным достижением структурной биологии и фактически заложила основы нанотехнологии молекулярных моторов [1].

Схема молекулы миозина II.
Молекула состоит из двух длинных полипептидов (тяжелых цепей), формирующих две глобулярные головки и стержнеобразный хвост, участвующий в образовании филаментов. Головки содержат актин-связывающие участки (А) и моторные области (М), где происходит связывание и расщепление АТФ. Вблизи головок с тяжелыми цепями ассоциированы две пары легких цепей, одна из которых содержит участок фосфорилирования (Ф).
Все миозины независимо от их происхождения (будь то сократительный аппарат скелетных мышц, сердца, гладких мышц сосудов или немышечных клеток), хотя и кодируются разными генами, в общем устроены одинаково. Те отличия в первичной структуре, которые существуют между ними, зачастую определяют особенности их надмолекулярной организации и регуляции, а также мощность мотора. В разных типах клеток эти различия сказываются на общей организации актомиозинового двигательного аппарата. В частности, основные типы клеток сердечно-сосудистой системы - мышечные клетки сердца (кардиомиоциты), гладкомышечные клетки сосудов, клетки сосудистого эндотелия и фибробласты - имеют четко различимую организацию актомиозина.

Сократительные системы

Сократительный аппарат кардиомиоцитов, так же как и клеток скелетных мышц, состоит из множества последовательно соединенных единиц - сакромеров. К их стенкам (Z-дискам) прикреплен один из концов актиновых филаментов, второй - свободно "висит" внутри, окруженный и поддерживаемый биполярными филаментами миозина, которые заполняют центр саркомера и также связаны с Z-дисками гигантским белком титином. Из-за упорядоченности саркомеров под микроскопом скелетные и сердечные мышцы выглядят поперечно исчерченными и потому называются поперечнополосатыми. Сокращение таких мышц происходит при стягивании краев саркомера путем "перешагивания" моторных доменов миозина вдоль актиновых филаментов и их протаскивания к центру саркомера. Титин выполняет роль молекулярной пружины, поддерживая структуру сакромера. Сложение небольших изменений длины или напряжения каждого саркомера достигает значительных величин на уровне мышечной клетки и мышечных волокон в целом. Постоянная активность и готовность саркомерного миозина к работе - характерная его особенность. Блокировка сокращения достигается путем запрета взаимодействия миозиновых головок с актином, что осуществляет специальный белковый (тропонин-тропомиозиновый) комплекс, расположенный на филаментах актина. Запуск сокращения происходит при возрастании концентрации ионов кальция в цитоплазме кардиомиоцитов, который связывается с тропонином и снимает его блокирующее действие.

Электронная микрофотография (вверху) и схема строения саркомера скелетных и сердечных мышц.
Саркомер ограничен Z-линиями, с которыми соединены филаменты актина и белок титин. Филаменты миозина расположены в центре саркомера, и их упорядоченная структура поддерживается за счет латеральных взаимодействий с титином и филаментами актина. Центральная зона саркомера, соответствующая середине миозиновых филаментов, свободна от головок.

Двигательный аппарат гладкомышечных клеток не имеет саркомеров, однако, как и в поперечнополосатых мышцах, он организован в постоянную структуру, в которой с помощью электронной микроскопии можно увидеть четко выделяющиеся продольно взаимодействующие филаменты актина и миозина, а также аналоги Z-дисков - плотные тельца. Сам по себе гладкомышечный миозин неактивен, так как его моторные домены плотно ассоциированы друг с другом и стволом филамента. Активация происходит под действием специального Са²⁺-зависимого фермента (киназы легких цепей миозина, КЛЦМ), который переносит фосфатный остаток с АТФ на регуляторные легкие цепи миозина. Такая, казалось бы, незначительная модификация приводит к колоссальным последствиям - к освобождению головок, что позволяет им связывать актин и АТФ и развивать тянущее усилие.

Сходным образом регулируется и двигательная активность немышечных клеток. Клетки, например, эндотелия сосудов, фибробласты сердца и тромбоциты содержат миозин II, подобный гладкомышечному. Однако их сократительный аппарат не собран в постоянную структуру, и большая часть молекул немышечного миозина находится в одиночном или "свернутом" состоянии, при этом филаменты не формируются. Фосфорилирование немышечного миозина КЛЦМ имеет два последствия. Во-первых, молекулы миозина разворачиваются и полимеризуются в филаменты. Во-вторых, происходит активация моторного домена. В результате в определенной области немышечной клетки создается временный сократительный аппарат, который инактивируется и разбирается после завершения двигательного акта путем дефосфорилирования миозина. Как и в гладких мышцах, за это отвечает фермент-антагонист КЛЦМ - фосфатаза легких цепей миозина. Замечательная пластичность двигательной системы немышечных клеток, вероятно, объясняется тем, что они призваны совершать разнообразные движения при ограниченном ресурсе сократительных белков, тогда как мышечные клетки узкоспециализированы и выполняют лишь одну функцию - однонаправленного сокращения.

Белки-регуляторы

Молекулярно-генетические исследования локуса КЛЦМ в геноме высших позвоночных, начатые более 10 лет назад, оказались фундаментально важными, поскольку позволили выявить значительно более сложную систему регуляции клеточной подвижности с участием КЛЦМ, нежели просто фосфорилирование миозина. Выяснилось, что хромосомный локус КЛЦМ имеет сложное строение, выпадающее из общепринятого тогда принципа "один ген - один белок". Этот локус кодирует три семейства белковых продуктов: высокомолекулярную (характерную для клеток эндотелия и эпителия) и низкомолекулярную (основную во всех остальных клетках) изоформы КЛМЦ, а также белок KRP (от англ. Kinase-Related Protein, что отражает его родство с КЛЦМ) [2, 3]. Именно ген KRP и представляет собой пример "гена в гене" - он расположен внутри гена КЛЦМ, использует ту же рамку считывания, но при этом полностью независим [4]. Такое устройство генома ранее наблюдали у вирусов, считая его примером эволюционной "компрессии" генетической информации. Однако полная расшифровка генома человека показала, что такая структура может быть типичной и для высокоорганизованных организмов. Были обнаружены и другие примеры так называемых генов-матрешек, в которых кодирующие нуклеотидные последовательности вставлены одна в другую, поэтому каждый меньший по размеру белок существует и отдельно, и как часть большего белка. Соответственно, высокомолекулярный белок наследует все свойства низкомолекулярного компонента и дополнительно проявляет свои собственные. Так, KRP взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозинами и собирает их в филаменты. В то же время, миозиновый мотор запускает КЛЦМ, а не KRP, поскольку в его составе нет необходимых аминокислотных последовательностей, определяющие протеинкиназную активность. Более того, в клетках, где есть оба этих регулятора, KRP становится антагонистом КЛЦМ, нарушая ее взаимодействие с миозином.

Регуляция динамики миозина в клетке.
В немышечной клетке около половины всех молекул миозина находятся в свернутом состоянии и не способны образовывать филаменты. Фосфорилирование (Ф) легких цепей миозина КЛЦМ активирует миозин и нарушает внутримолекулярные связи, приводя к распрямлению молекул миозина и их спонтанной полимеризации в активные филаменты, готовые к генерации силы. При дифференцировке гладкомышечных клеток формируются длинные филаменты с боковой полярностью, при которой моторные головки плотно упакованы сбоку филамента и взаимодействуют с соседними филаментами актина, создавая продольные тянущие усилия. При развитии клеток скелетных мышц и сердца происходит замена немышечных изоформ миозина на саркомерный миозин II, который формирует ограниченные по длине гантелеобразные филаменты с моторными частями на концах филамента и средней частью, содержащей только хвосты. В созревающих кардиомиоцитах (показано на врезке) и гладкомышечных клетках функционирует дополнительный путь формирования филаментов из несаркомерного миозина. Генетически родственный КЛЦМ белок KRP распрямляет молекулу миозина, но не включает ее моторную активность. В результате собираются неактивные миозиновые филаменты, которые, вероятно, играют важную роль в поддержании структуры сократительных волокон в гладких мышцах и предшественников миофибрилл в сердце. Активность этих филаментов также регулируется КЛЦМ и фосфатазой легких цепей миозина.

Таким образом, хотя принцип сокращения скелетных, сердечных и гладких мышц и немышечных клеток одинаков, основные пути регуляции сокращения в этих системах различаются. Тем не менее саркомерный миозин также может фосфорилироваться и изменять силовые характеристики, а в гладкой мышце функционирует система инактивации сокращения, связанная с филаментами актина и основанная на участии гладкомышечного аналога тропонина - белка кальдесмона. В мускулатуре сосудов координированная деятельность обеих систем играет важную роль в регуляции тонуса, что было установлено в результате многочисленных исследований, проведенных в том числе и в нашей лаборатории. Тонус сосудов напрямую зависит от активности КЛЦМ и кальдесмона в гладкомышечных клетках. При гиперактивации КЛЦМ и подавлении функций кальдесмона развивается спазм и ишемическое поражение тканей, например, инфаркт миокарда в случае коронарных артерий или инсульт при спазме сосудов головного мозга. Снижение активности КЛЦМ, напротив, приводит к расслаблению сократительной системы гладких мышц сосудов, снижению артериального давления и восстановлению кровоснабжения сердца. На этом основано действие некоторых кардиологических препаратов (антагонистов кальция, нитратов, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, папаверина и бета-блокаторов).

Нарушения клеточной подвижности

Важное свойство гладкомышечных клеток сосудов - их способность перестраивать сократительный аппарат и метаболизм и превращаться в фибробластоподобные клетки. Это происходит, в частности, в результате нарушения целостности эндотелиальной выстилки сосудистой стенки и прямого контакта содержащихся в крови факторов роста с гладкомышечными клетками интимальной (внутренней) оболочки сосудов. Такие клетки начинают активно мигрировать в направлении пораженного участка, размножаться и секретировать белки внеклеточного матрикса, заполняя просвет сосуда. Эти события происходят при атеросклерозе, часто после ангиопластики и аортокоронарного шунтирования, вызывая повторное сужение сосудистого русла, или рестеноз. Миграция, деление и секреторная активность гладкомышечных клеток также опосредуются изменениями активностей миозина II, КЛЦМ и кальдесмона. Очевидно, что если научиться селективно подавлять эти процессы, можно предотвратить формирование рестенозов. И такие попытки уже делаются, наиболее перспективны из них - применение синтетических ингибиторов КЛЦМ, а также воздействие на кальдесмон-зависимую систему регуляции.

Недавно была установлена важная роль эндотелиальной высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в регуляции сосудистой проницаемости, необходимой для обмена биологически активными молекулами, питательными веществами, газами и клетками иммунной системы между кровью и тканями организма [10]. У мышей с избирательным генетическим нокаутом этой изоформы КЛЦМ существенно снижена проницаемость микрососудов, в том числе и для токсических веществ, которые проходят из кровотока в ткань и вызывают ее поражение. Сокращение эндотелия опосредуется немышечным миозином и регулируется главным образом КЛЦМ. Ее отсутствие в клетках эндотелия приводит к уменьшению проницаемости монослоя, по-видимому, за счет потери способности клеток к сокращению и образованию щелей между ними, в которые могут проходить белковые молекулы и даже клетки. Примечательно, что тех же эффектов можно добиться, вводя в кровь нормальным мышам ингибитор КЛЦМ, одной из первых мишеней которого будет эндотелий сосудов. Сегодня ученые думают о том, как использовать антагонисты КЛЦМ в кардиологии. Одним из возможных применений может стать ограничение поражения миокарда при операциях на сердце. Временная остановка кровообращения в сердце приводит к ишемии и повышению проницаемости капилляров, а восстановление кровотока - к разносу токсических продуктов метаболизма из зоны ишемии в здоровые участки миокарда. Включение ингибитора КЛЦМ в кардиопротективные растворы может, таким образом, снизить масштабы повреждения сердца при операциях. Другими областями применения ингибиторов КЛЦМ могут быть отек легких, кардиогенный и травматический шок, сепсис и другие патологии, при которых остро нарушается сосудистая проницаемость.

Исследования последних лет, проведенные в нашей лаборатории, показывают, что присутствие КЛЦМ и KRP критично на самых ранних этапах развития кардиомиоцитов и необходимо для формирования правильной саркомерной структуры. Если избирательно подавить синтез этих белков с помощью так называемых антисмысловых олигонуклеотидов (коротких фрагментов ДНК, взаимодействующих с информационной РНК, кодирующей данный белок), то в эмбриональных кардиомиоцитах практически останавливается образование саркомеров и клетки теряют способность сокращаться. Поскольку ни КЛЦМ, ни KRP не взаимодействуют с саркомерным миозином, то наиболее вероятной молекулярной мишенью для них становится немышечный миозин, также присутствующий в кардиомиоцитах. Он входит в состав предшественников миофибрилл (премиофибрилл) и должен находиться в филаментарном состоянии для того, чтобы премиофибриллы слились друг с другом и образовали полноценные сократительные волокна, состоящие из саркомеров. По всей видимости, роль КЛЦМ и KRP состоит в поддержании филаментарного состояния немышечного миозина премиофибрилл, без которого их дальнейшее развитие невозможно. Таким образом, белковые продукты генетического локуса КЛЦМ - важные участники формирования сердца у эмбриона.

Микрофотографии актиновых филаментов нормальных эмбриональных кардиомиоцитов (вверху) и обработанных антисмысловым олигонуклеотидом к мРНК КЛЦМ и KRP, избирательно подавляющим синтез этих белков. Расположение белка a-актинина, образующего Z-диски, выявляли красным флуоресцентным красителем. В контрольных кардиомиоцитах видны формирующиеся саркомеры, в клетках без КЛЦМ и KRP образование саркомеров нарушено.

Процесс образования новых миофибрилл происходит и во взрослом сердце. Как известно, клетки сердца не делятся, но способны отвечать на возрастающую гемодинамическую нагрузку путем увеличения массы и мощности сократительного аппарата. Такая гипертрофия сердца может происходить как в норме (например, у спортсменов, испытывающих большие физические нагрузки), так и при заболеваниях сердца различной этиологии. В наиболее тяжелых формах разрастание ткани сердца приводит к сокращению размеров его камер, снижению объема выбрасываемой крови и представляет угрозу для жизни пациента. Единственный радикальный в наши дни метод лечения таких состояний - оперативное удаление части миокарда, которое продлевает жизнь больного, но не устраняет причину заболевания. Исследование молекулярных механизмов гипертрофии миокарда может дать ту необходимую информацию, которая позволит установить диагноз на ранней стадии, провести фармакологическое лечение и избежать операции. Ранними маркерами гипертрофии и соответственно потенциальными мишенями для воздействия лекарств могут быть именно КЛЦМ и KRP. В экспериментах на животных установлено, что гипертрофия миокарда сопровождается увеличением синтеза этих белков [11, 12]. Эти данные были подтверждены и при обследовании людей, страдающих той же патологией [13]. Вероятно, при гипертрофии сердечная клетка запускает тот же молекулярный механизм, что и в эмбриональный период, когда происходил синтез миофибрилл, регулируемый КЛЦМ и KRP. Подавив в культивируемых кардиомиоцитах биосинтез этих регуляторных компонентов, удалось остановить сборку миофибрилл. Остается лишь разработать антигипертрофические лекарственные препараты, и бороться с этим тяжелейшим недугом человека станет намного проще.

Значительно сложнее лечить наследственные формы гипертрофии миокарда, связанные с мутациями генов, кодирующих синтез миозина, тропонина, титина и других белков саркомера. Естественно, организм сам пытается справиться с возникшими нарушениями, но вновь синтезированные миозиновые моторы или аномальные саркомеры также несут врожденные дефекты, и это только усугубляет положение. Сейчас такие заболевания уже можно выявить с помощью генетических методов, а в перспективе, с дальнейшим развитием методов генной и клеточной терапии, их можно будет лечить, заменяя дефектные гены или несущие их клетки на нормальные. Ясно, что для успешной репарации компонентов сердечно-сосудистой системы совершенно необходимы фундаментальные исследования в области клеточной подвижности, ведь список белковых компонентов двигательной системы клетки не ограничивается миозином, КЛЦМ и KRP, рассмотренных в этой короткой статье. Более того, регулярно появляются сообщения об открытии новых белков, участвующих в клеточной подвижности, что отражает сложность и многогранность процесса. Его изучение сегодня требует мультидисциплинарного подхода, и есть все основания ожидать, что многие полученные на этом пути знания рано или поздно найдут применение в практической кардиологии и других областях медицины.

Литература

1. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K. et al. // Science. 1993. V.261. P.50-58.

2. Watterson D.M., Collinge M., Lukas T.J. et al. // FEBS Lett. 1995. №373. P.217-220.

3. Birukov K.G., Schavocky J.P., Shirinsky V.P. et al. // J. Cell Biochem. 1998. №70. P.402-413.

4. Vorotnikov A.V. // J. Biochem. Cell Biol. 1997. №29. P.727-730.

5. Ширинский В.П. // Рос. физиол. журнал им.И.М.Сеченова. 1999. Т.85. №6. С.798-812.

6. Воротников А.В., Крымский М.А., Ширинский В.П. // Биохимия. 2002. Т.67. С.1587-1610.

7. Воротников А.В., Крымский М.А., Хапчаев А.Ю., Серебряная Д.В. // Рос. физиол. журнал им.И.М.Сеченова. 2004. Т.90. №6. С.705-518.

8. Ткачук В.А., Воротников А.В., Гришина З.В., Степанова В.В. // Фундаментальные исследования и достижения в кардиологии. М., 2002. С.31-39.

9. Goncharova E.A., Vorotnikov A.V., Gracheva E.O. et al. // Biol. Chem. 2002. №383. P.115-126.

10. Wainwright M.S., Rossi J., Schavocky J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. №100. P.6233-6238.

11. Dudnakova T.V., Lakomkin V.L., Tsyplenkova V.G. et al. // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2003. №41. P.788-794.

12. Dudnakova T.V., Lakomkin V.L., Tsyplenkova V.G. et al. // Mol. Cell. Biochem. 2003. №252. P.173-181.

13. Браниште Т.А., Дуднакова Т.В., Дергилев К.В. и др. // Кардиология. 2004. №12. С.31-36.