№6, 2007 г.
© Жданова Н.С.
Нить Ариадны в генетике
Н.С. Жданова
Наталья Сергеевна Жданова, д.б.н., вед. научн. сотр. лаб. генетики развития.Карты геномов животных и растений - это нить Ариадны, придерживаясь которой, генетики отыскивают нужные гены, изучают, как организован геном и как он эволюционирует, как наследуются гены и признаки. Эта нить ведет исследователей и в мир сугубо практических забот - помогает понять, как в нормальном и больном организмах взаимодействуют гены и их продукты, отыскать оптимальные стратегии селекции сельскохозяйственный животных и организовать медико-генетическое консультирование. Особенно необходимы подробные карты геномов человека, а также тех видов млекопитающих, что используются в качестве модельных объектов в генетических исследованиях.
На службе межвидовые клеточные гибриды
В настоящее время геномные карты представляют собой результат объединения генетических, цитогенетических и физических карт, а также данных о секвенировании ДНК всего генома или отдельных хромосомных районов. Такая карта выглядит как схема, на которой в определенном порядке и на определенном расстоянии друг от друга нанесены маркеры, роль которых могут играть либо морфологические и физиологические признаки организма, либо гены и их продукты, либо отдельные последовательности ДНК.
Разные типы карт отличаются способом получения. В начале XX в. картирование проводилось на основе гибридологического анализа: изучалось наследование признаков в первом и втором поколениях гибридов от скрещивания особей, различающихся по нескольким признакам. Однако из-за длительности репродуктивного периода, малого числа потомков и отсутствия в то время методов выявления полиморфных признаков подробные генетические карты млекопитающих созданы лишь недавно.
Прорыв в картировании генома человека и других видов млекопитающих наступил в 60-х годах прошлого столетия [1]. Тогда появилась идея заменить скрещивание особей - слияние их генеративных клеток - слиянием соматических клеток разных видов животных. Этому предшествовали многолетние исследования по неограниченному размножению клеток вне организма (in vitro) в специальных средах на стекле или пластиковых подложках. Такие клеточные культуры получили название длительно перевиваемых. Клетки этих линий по некоторым свойствам отличаются от обычных, так как большинство ведет свое происхождение от опухолевых клеток, содержащих перестроенные хромосомы.
Чтобы клеточные гибриды могли неограниченно размножаться in vitro, необходимо в качестве хотя бы одного из родителей использовать именно длительно перевиваемые клетки. Роль второго родителя обычно играют нормальные клетки, выделенные непосредственно из организма. Для этой цели удобны лейкоциты периферической крови. При спонтанном или индуцированном слиянии клеток сначала формируются многоядерные клетки (гомо- или гетерокарионы), а затем, когда сольются ядра, образуется гибридная клетка. Размножившись, она дает гибридный клон.
Долго считалось, что спонтанно сливаются клетки только в культурах, а в организме, если это и случается, отбор выбраковывает возникшие гибриды. Однако недавно исследователи наблюдали спонтанное слияние трансплантированных клеток костного мозга с мутантными гепатоцитами мышей. В результате образовывались гибридные клетки, в которых восстанавливалась утраченная ранее функция гепатоцитов.
Первоначально область применения межвидовых гибридов соматических клеток была довольно обширной. Длительное время на гетерокарионах и соматических гибридах изучались реактивация геномов, активация и подавление экспрессии генов, роль в этих процессах ядра и цитоплазмы. Используя клеточные гибриды, впервые удалось показать, что в нормальных клетках человека существуют гены, подавляющие злокачественный рост. В настоящее же время такие гибриды используются в основном для картирования хромосом. Как же с помощью гибридов картировать гены?
Уже в первых работах по изучению хромосомного состава межвидовых клеточных гибридов выяснилось, что они случайным образом теряют хромосомы одного из родительских видов (как правило, родителя с нормальным кариотипом). Это свойство привлекло создателей генетических карт, поскольку с утратой хромосомы в гибриде исчезают и локализованные в ней маркеры.
Первую попытку связать локализацию гена с сохранением в гибридах “человек-мышь” определенной хромосомы человека предприняли в начале 70-х годов. Поскольку в гибридных клонах была выявлена корреляция между наличием в них хромосомы 17 человека и тимидинкиназы 1, то ген фермента был отнесен именно к этой хромосоме (рис.1).
Рис. 1. Схема получения гибридных клонов “человек-мышь” и локализации гена тимидинкиназы 1 (ТК1).
Длительно перевиваемые клетки мыши, в которых этого гена нет, и лейкоциты периферической крови человека обрабатывают полиэтиленгликолем (ПЭГ), в результате чего структура мембран нарушается так, что те и другие клетки слипаются, а затем сливаются, образуя двух- или многоядерные гетерокарионы. После синхронизации и вступления ядер в митоз или за счет их прямого слияния формируется гибридная клетка с ядром, содержащим хромосомы обоих родительских видов. В используемой селективной среде погибают мышиные клетки, не имеющие активного гена ТК1 (необходимого для биосинтеза ДНК), и лейкоциты человека, поскольку без специальных стимуляторов они in vitro не делятся. Выживают только гибридные клетки, в которые лейкоциты привнесли ген ТК1. Из таких клеток образуются гибридные клоны, и из них создают статистическую картирующую панель. Из-за случайных потерь человеческих хромосом разные клоны содержат разные хромосомы. Здесь показаны две клетки клонов с хромосомой 17 (хр. 17 +) человека, а поскольку в них проявляется активность ТК1 (+), ее ген был отнесен именно к этой хромосоме.В середине 80-х годов основным инструментом картирования хромосом человека стали панели гибридных клонов. Панель - это набор клеточных гибридов, в которых статистически представлен весь геном изучаемого вида (таблица). Как правило, с помощью клеточных гибридов можно определить, в какой именно хромосоме локализованы те или иные маркеры. Если они находятся в одной и той же хромосоме, их называют “синтенными”. Однако этим способом можно картировать только те признаки, которые проявляют межвидовой полиморфизм, т.е. отличаются у родительских видов по каким-либо параметрам. Кроме того, картируемый признак не должен подавляться или активироваться в гибридах. Уже в 80-х годах на карту хромосом человека было нанесено около 600 генов. Эти успехи открыли дорогу для картирования хромосом других видов млекопитающих.
С использованием панели гибридов клеток американской норки и бурозубки обыкновенной с клетками мыши или китайского хомячка в нашем институте построены карты хромосом норки и бурозубки. В хромосомах бурозубки было локализовано 49 генов и четыре высоко полиморфных просто выявляемых маркера - микросателлита * (рис.2), а в хромосомах норки - около 130 генов и 40 микросателлитов [2]. И хотя последние не кодируют никаких признаков, а функция их окончательно не ясна, они вполне пригодны в качестве реперов на карте, к которым можно “привязать” важные для нас признаки. Изучив, например, сцепление между микросателлитами и генами окраски американской норки, удастся локализовать эти гены в хромосомах и использовать микросателлиты для оптимизации селекции норок с нужной окраской меха.
* Микросателлиты - короткие последовательности ДНК, в которых мотив из нескольких нуклеотидов повторен много раз.
Рис. 2. Синтенная карта хромосом бурозубки обыкновенной.
Под каждой схематически изображенной хромосомой приведено ее обозначение (латинские буквы),
а справа - гены и микросателлиты (буквенно-численные символы);
цветом отмечены консервативные районы хромосом человека (цифры и числа) в хромосомах бурозубки.Идентификация в клеточных гибридах всего генетического материала вида необходима для использования их в картировании. Не выявленные хромосомные перестройки станут источником ошибок, но если перестройки идентифицированы, они послужат для внутрихромосомной локализации маркеров, т.е. отнесения их к определенному хромосомному району. Подобный пример - клеточные гибриды свиньи. Они содержали большое число перестроенных хромосом, что надолго задержало их картирование. Но когда в гибридных клонах методами молекулярной цитогенетики были идентифицированы фрагменты, из которых состояли перестроенные хромосомы, появилась возможность отнести маркеры к конкретным хромосомным районам (рис.3, 4).
Рис. 3. Результаты идентификации девятой хромосомы свиньи в гибридном клоне “свинья-американская норка”.Слева: идентифицированные дифференциальной окраской красителем Гимза хромосомы свиньи на фоне хромосом норки, где стрелкой указано положение девятой хромосомы. В середине: она же (указана стрелкой) в препарате, полученном в результате прямой гибридизации in situ (ДНК свиньи была гибридизована с хромосомами клона). Справа: отчетливо видимые две светлые фигуры - это хромосомы свиньи, выявленные после обратной гибридизации (фракция ДНК свиньи из клона гибридизована с ее хромосомами).
Рис. 4. Микрофотографии дифференциально окрашенных нормальной (N) второй хромосомы норки и трех перестроенных вариантов (стрелкой указана транслокация фрагмента хромосомы 2 на хромосому хомячка) и схема хромосомы с нанесенными на нее генами. Для картирования служили перестроенные хромосомы из разных гибридных клонов “американская норка-китайский хомячок”. На схеме скобками указаны районы локализации картированных генов, а их обозначения даны символами; p и q - плечи хромосомы.Если перед слиянием клеток специально разорвать хромосомы, можно ли использовать полученные таким образом гибриды для картирования? Оказалось, можно. Речь идет об особом типе межвидовых клеточных гибридов - радиационных. Они образуются в результате слияния перевиваемых клеток и нормальных, которые предварительно облучают летальной дозой радиации [3].
В радиационных гибридах статистически сохраняются не только фрагменты хромосом, содержащие центромеру и гены, необходимые для выживания клонов, но и фрагменты, перенесенные на партнерские хромосомы (рис.5). Удалось даже получить радиационные гибриды между клетками млекопитающих и рыб и использовать для картирования хромосом последних.
Рис. 5. Результаты идентификации генетического материала свиньи в радиационном гибриде, полученном от слияния перевиваемых клеток китайского хомячка и клеток свиньи, облученных дозой 6000 рад. Прямой гибридизацией выявлены в этом клоне два фрагмента (светлые фигуры) хромосомы свиньи, перенесенные на хромосомы хомячка (слева), а обратной гибридизацией получено доказательство, что эти фрагменты представляют собой районы второй хромосомы свиньи.В основе радиационного картирования геномов лежат работы английских исследователей С.Госса и Г.Харриса [4-6]. Они не только опередили время на четверть века, но и очертили большинство направлений в изучении радиационных гибридов как феномена и в использовании их для картирования хромосом. Способ получения таких гибридов до сих пор остался неизменным, изменились лишь методы статистической обработки экспериментальных данных. Созданные компьютерные программы позволяют одновременно анализировать несколько тысяч маркеров.В зависимости от дозы облучения нормальных клеток получаются панели, благодаря которым можно построить радиационные карты разной степени разрешения. Сначала были получены радиационные гибриды от слияния с клетками, облученными дозой в диапазоне 3-10 тыс. рад. Используя панели человека из таких гибридов, американские ученые определили порядок около 6 тыс. микросателлитов и маркеров экспрессирующихся генов. И хотя по сравнению с другими картами человека эти были более высокого разрешения, на них маркеры на расстоянии 4 тыс. пар нуклеотидов разделялись с невысокой степенью достоверности. Чтобы повысить разрешение радиационных карт, исследователи получили панели, составленные из гибридов с нормальными клетками человека, облученными более высокой дозой радиации, 40 тыс. рад. На сконструированной карте с высокой степенью достоверности разделялись маркеры на расстоянии всего в 100 пар нуклеотидов. Цена высокой степени разрешения - невозможность выстроить протяженные участки карты. Как правило, такое картирование служит для изучения генетического окружения интересующих локусов. Оно применено, например, при исследовании хромосомных районов свиньи, в которых локализованы главные гены, влияющие на качество мяса или число потомков в помете. Таким образом, с помощью радиационного картирования в настоящее время получают самые подробные хромосомные карты.
Рис. 6. Радиационная (слева) и цитогенетическая карты хромосомы 12 свиньи.
Карта построена с помощью радиационной панели, содержащей 118 клонов, полученных французскими учеными в результате слияния клеток свиньи, облученных 7000 рад, с клетками китайского хомячка [7]. Образцы ДНК панели были переданы ученым разных стран, что позволило быстро построить радиационную карту. Картированные нами гены обозначены красным шрифтом, а микросателлиты, картированные другими учеными, - черным. Вертикальными линиями вдоль цитогенетической карты дифференциально окрашенной хромосомы обозначены районы локализации некоторых маркеров в хромосоме. Относительные расстояния между маркерами на радиационной карте даны в условных единицах - cR; стрелкой указано возможное положение центромеры.Итак, на основе радиационной панели удается выстроить в определенном порядке сотни и тысячи маркеров и определить между ними относительные расстояния. На выходе получают некое число синтенных групп маркеров, обычно превышающее количество хромосом у вида. Иными словами, группа сцепления одной хромосомы оказывается раздробленной. Точки разрывов почти всегда расположены в центромерных и субтеломерных районах хромосом, но могут находиться и в других местах. Разорванность карты в первую очередь отражает неравномерность распределения радиационных разрывов по длине хромосомы. Как “привязать” синтенные группы к конкретным хромосомам и ориентировать по их длине? Для этого несколько маркеров из каждой группы необходимо локализовать непосредственно в хромосомах с помощью цитогенетических методов картирования, например флуоресцентной гибридизацией in situ, которая позволяет увидеть, в какой хромосоме и в каком ее районе находится маркер (рис.6).Все познается в сравнении
В первых же работах по картированию геномов млекопитающих с помощью межвидовых гибридов соматических клеток выяснилось, что гены, синтенные у одного вида, синтенны и у других видов. Удивительно, но некоторые ассоциации генов прослеживаются вплоть до птиц и костистых рыб. Наличие в геномах таких консервативных, или гомеологичных, районов вызвало большой интерес у исследователей, и в дальнейшем сформировалось целое направление - сравнительное картирование, вошедшее в состав геномики, науки о структуре и эволюции геномов.
Консервативными бывают и целые хромосомы. Например, один и тот же набор генов содержат 17-я хромосома человека, 19-я коровы, 12-я свиньи и т.д. Другие консервативные участки существенно меньше по размеру. Сравнительное картирование недаром стало самостоятельной ветвью геномики - оно дает массу интереснейшей информации. Так, сопоставлением радиационных карт млекопитающих с результатами секвенирования геномов человека и мыши установлено, что в сайтах эволюционных разрывов между крупными консервативными районами, как правило, локализованы буквально единичные гены или небольшие последовательности размером около миллиона пар нуклеотидов из других, тоже консервативных, районов. Интересными в этом отношении оказались перицентромерные области хромосом (рис.7). У свиньи, например, в них содержатся маркеры, которые не принадлежат собственным консервативным участкам перицентромеры. Это свидетельствует о высокой скорости хромосомных перестроек в тех местах, где в ходе эволюции кариотипов образуются новые центромеры.
Рис. 7. Основные элементы структуры хромосом. Центромера (ЦМ) - это нуклеопротеидный комплекс, состоящий из видоспецифичных повторенных последовательностей ДНК и одинаковых у всех млекопитающих белков, которые отвечают за правильное поведение хромосом при делении клеток. Перицентромера (ПЦ) прилегает непосредственно к центромере и обогащена разного рода повторяющимися последовательностями. Терминальная (ТР) часть хромосом включает теломеру (Т) и субтеломеру (СТ). Теломера у всех млекопитающих состоит из многократно тандемно повторенного мотива из шести нуклеотидов. Ее специфическая организация и механизм репликации ДНК предохраняют хромосомы от слияния и обусловливают их целостность. Субтеломера - это буфер между теломерой и основным телом хромосомы, где локализованы гены, и содержит большое количество повторенных участков ДНК. В субтеломерах хромосом человека есть деградированные теломерные повторы, иные удвоенные последовательности и сегментные дупликации; у других видов млекопитающих здесь может содержаться сателлитная ДНК - короткий мотив, повторенный до 100 тыс. раз.С помощью сравнительного картирования удалось показать, что скорости, с которыми эволюционировали кариотипы разных видов млекопитающих, существенно разнятся. Так, предковые геномы плацентарных животных и мышевидных грызунов отделены, по-видимому, более чем 150-ю хромосомными перестройками, а хищных - только девятью. Геном свиньи образовался за счет 42 перестроек предкового генома парнокопытных, а геном коровы - за счет 99. Фактически в каждом отряде или семействе описаны и медленно, и быстро эволюционирующие виды. Человек, шимпанзе и гиббон - хотя и родственники, но относятся к разным семействам приматов. Однако кариотипы человека и шимпанзе идентичны, за исключением слияний нескольких хромосом, тогда как 26 хромосом гиббона составлены из 70 фрагментов хромосом человека. Таким образом, скорость реорганизации кариотипов разных видов не всегда связана с их эволюционным положением.Судя по радиационным картам, в геномах рыбы Danio rerio и человека как минимум 247 гомологичных сегментов. И эта величина сравнима с той (201), которая на том же уровне разрешения карт была определена для мыши и человека. Оказалось, что каждая хромосома D.rerio содержит от двух до семи блоков, встречающихся в разных хромосомах человека. Еще примеры несоответствия: число консервативных районов в геномах курицы и человека составляет 154, а курицы и мыши - 312.
Складывается впечатление, что геномы, по крайней мере млекопитающих, состоят в основном из блоков, которые у разных видов соединены в разных комбинациях. Ограничения наложены, очевидно, на варианты кариотипов, “неудобных” для протекания таких главных клеточных процессов, как митоз и мейоз, или нарушающих допустимую архитектонику ядра.
При сравнении радиационных карт обнаружена новая эволюционная перестройка - изменение положения центромеры в консервативных районах. Этот феномен описан почти для всех хромосом коровы. Такой же тип перестройки нашли и мы, сопоставив радиационные карты нескольких хромосом свиньи и человека. Несмотря на то, что центромера отвечает за очень важную функцию - правильное поведение хромосом в митозе и мейозе, - ее положение в консервативных районах оказалось весьма лабильным.
Таким образом, сравнение радиационных карт разных видов позволяет выявлять состав, границы и порядок генов в консервативных районах, реконструировать их предковый состав и предковые кариотипы, определять скорость реорганизации кариотипов в разных ветвях эволюции.
Наличие консервативных районов невольно вызывает вопрос: где рвались хромосомы, когда формировался новый кариотип, в случайных или определенных местах? Долгое время отвечали - “в случайных”. Но в последние годы стали появляться данные о том, что это совершенно определенные хромосомные сайты. Более того, в эволюции кариотипов млекопитающих одни и те же районы неоднократно использовались в качестве и мест разрывов, и мест слияния. Разрозненные факты такого рода постоянно обращали на себя внимание исследователей, но закономерностью стали восприниматься после сравнения геномов восьми видов из пяти отрядов млекопитающих. В числе этих видов - человек, мышь и крыса с уже полностью расшифрованными геномами, собака, свинья, корова, кошка и лошадь с радиационными картами высокого разрешения. В кариотипах упомянутых животных выявлено около 1200 участков гомологичной синтении (консервативных районов, в которых сохранен не только состав, но и порядок генов хотя бы у двух видов). Кроме того, идентифицировано 367 хромосомных областей, которые разделяли участки гомологичной синтении, именно в них и были локализованы эволюционные разрывы. Но самым интересным оказалось то, что 20% таких районов неоднократно участвовали в реорганизации кариотипов. Остальные были специфичными для отдельных отрядов и видов [8].
Что же собой представляют те участки хромосом, которые неоднократно использовались в эволюции кариотипов млекопитающих? Чаще всего это центромерные, перицентромерные и терминальные области, насыщенные разного рода повторенными последовательностями. Геномы человека и мыши часто содержат в таких местах дуплицированные гены, причем у мыши члены одного и того же генного семейства расселены по разным хромосомам (это в конце концов может привести к образованию новых генов). В тех же районах находятся скопления L1- и других некодирующих повторов.
У приматов свой путь эволюции хромосом?
В геноме человека более половины участков, в которых неоднократно происходили эволюционные разрывы, содержат особые структуры, названные сегментными дупликациями. Они представляют собой много раз повторенные протяженные последовательности, целые гены или их части, и могут достигать размера в несколько сотен тысяч пар нуклеотидов. В геноме человека такие последовательности составляют 5%. Большое количество этих структур (около половины их образовалось относительно недавно) у приматов - характерная особенность их геномов. У других видов млекопитающих сегментных дупликаций существенно меньше.
В целом в геномах приматов положение примерно 90% районов, в которых происходили эволюционные разрывы, совпадает с локализацией сегментных дупликаций. Частота нарушения синтении в содержащих их сайтах в три раза выше, чем в сайтах, где они не обнаружены. Этот факт, а также наличие таких дупликаций и в местах ненарушенной предковой синтении свидетельствуют о том, что они способствовали появлению хромосомных перестроек в геномах приматов, а не были их следствием. Таким образом, эволюция их кариотипов оказалась непосредственно связанной с особенностями молекулярной эволюции их геномов.
У человека половина сегментных дупликаций находится в терминальных (субтеломерных) районах хромосом. Примером тому могут быть дупликации, в которых сосредоточены члены семейства генов, кодирующих обонятельные рецепторы. Блоки, содержащие по три гена из этого семейства, выявлены в субтеломерах четырнадцати хромосом, причем в четырех из них эти ассоциации образовались в результате как минимум двух обменов между концами негомологичных хромосом.
Из результатов молекулярного анализа сегментных дупликаций следует, что большинство из них образовалось за счет повторных актов негомологичной и неаллельной гомологичной рекомбинации ДНК. Субтеломеры - самые быстро эволюционирующие районы в геноме человека. В них высока скорость нуклеотидных замен и дупликаций не только крупных, но и небольших участков. По меткому выражению Е.В.Линардополу, изучавшей субтеломеры, они представляют собой и свалку отбросов молекулярной эволюции генома, и место, где образуются новые гены [9]. Такая организация объясняет предрасположенность терминальных районов хромосом человека к перестройкам.
Структура генома каждого вида, несомненно, формируется благодаря длительному отбору “подходящих” вариантов, и совсем не безразлично, в каком месте генома находится тот или иной ген. В многочисленных исследованиях показано, что по длине хромосом гены распределены не случайным образом. Их плотность выше в районах, обогащенных определенными нуклеотидами. Как правило, гены, локализованные в непосредственной близости друг от друга, эволюционируют со сходной скоростью и объединены в эволюционные единицы, а те, что экспрессируются в одной ткани и на конкретной стадии развития организма, образуют в хромосомах нечто напоминающее кластеры. * * *
За 30 лет, в течение которых активно ведутся работы по хромосомному картированию млекопитающих, разработаны методы, позволяющие с высокой точностью определять местоположение в хромосомах генов, признаков и нуклеотидных последовательностей. Получена геномная карта человека. Насколько она подробна, можно судить хотя бы по тому, что на нее нанесены почти все известные гены. Эта карта сыграла важную роль при расшифровке человеческого генома: помогла выстроить в определенном порядке короткие фрагменты ДНК и проверить правильность результатов секвенирования. С ними вместе карту генома можно рассматривать как единую виртуальную карту.
К сожалению, самые высокоразрешающие физические карты - радиационные - созданы лишь для десятка видов млекопитающих. Среди них нет даже представителей всех отрядов этого класса животных. Построить такие карты для большего числа видов и изучить, что же лежит в основе эволюции кариотипов млекопитающих всех отрядов, а не только приматов, - задача будущих исследований. Образно говоря, нить Ариадны, которая ведет по лабиринтам генетики, надо еще плести и плести.
Литература
1. Эфрусси Б. Гибридизация соматических клеток. М., 1976.
2. Kuznetsov S.B., Matveeva N.M., Murphy W.J. et al. // Journal of Heredity. 2003. V.94. №5. P.386-391.
3. Жданова Н.С. // Генетика. 2002. Т.38. С.581-595.
4. Goss S.J., Harris H. // Nature. 1975. V.255. P.680-684.
5. Goss S.J., Harris H. // J. Cell Sci. 1977. V.215. P.17-37.
6. Goss S.J., Harris H. // J. Cell Sci. 1977. V.215. P.39-57.
7. Yerle M., Pinton P., Robic A. et al. // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V.82. P.182-188.
8. Murphy W.J., Larkin D.M., Everets-van der Wind A. et al. // Science. 2005. V.309. P.613-617.
9. Linardopoulou E.V., Williams E.M., Fan Y. et al. // Nature. 2005. V.437. P.94-100.
